大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)酶聯(lián)免疫檢測
試劑盒使用說明書 AE90828Ra
使用前仔細閱讀本說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術原理，
來檢測大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學診斷。
用 途：用于大鼠血清、血漿及相關液體樣本中 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)測
定。
工作原理
本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中
大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平。向預先包被了大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)
單克隆抗體的酶標孔中加入 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，溫育；溫育后，加入生物
素標記的抗 P 抗體。再與鏈霉親和素-HRP 結合，形成免疫復合物，再經(jīng)過溫育
和洗滌，去除未結合的酶，然后加入底物 A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉
化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的濃度呈正
相關。
試劑盒組成
試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存
說明書 1 份 1 份
封板膜 2 片（48） 2 片（96）
密封袋 1 個 1 個
酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標準品 800pg/ml 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
標準品稀釋液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
鏈霉親和素-HRP 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
生物素標記的抗 P
抗體
0.5ml×1 瓶 1 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存
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需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標準規(guī)格酶標儀。
3． 精密移液器及一次性吸頭
4． 蒸餾水，
5． 一次性試管
6． 吸水紙
注意事項
1． 從 2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少 30 分鐘。酶標包
被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差
3． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
4． 為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。
5． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
6． 底物 B 對光敏感，避免長時間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下
用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少 0.35ml 注入孔內，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需
要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中
標本要求
1．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
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2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實
驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
操作程序
1. 標準品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小
試管中進行稀釋。)
400pg/ml 5 號標準品 120μl 的原倍標準品加入 120μl 標準品稀釋液
200pg/ml 4 號標準品 120μl 的 5 號標準品加入 120μl 標準品稀釋液
100pg/ml 3 號標準品 120μl 的 4 號標準品加入 120μl 標準品稀釋液
50pg/ml 2 號標準品 120μl 的 3 號標準品加入 120μl 標準品稀釋液
25pg/ml 1 號標準品 120μl 的 2 號標準品加入 120μl 標準品稀釋液
2. 根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白
孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3. 加樣：1）空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗 8-OHdG 抗體，鏈
霉親和素-HRP，只加顯色劑 A&B 和終止液，其余各步操作相同；2）標準品
孔：加入標準品 50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素
抗體，故不加)；3）代測樣品孔：加入樣本 40ul，然后各加入抗 8-OHdG 抗
體 10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育 60
分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后
棄去，如此重復 5 次，拍干。
6. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50ul，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃
避光顯色 15 分鐘.
7. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
8. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應
在加終止液后 10 分鐘以內進行。
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9. 根據(jù)標準品的濃度及對應的 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)
樣品的 OD 值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟
件來計算。
操作程序總結：
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù) R 值為 0.92 以上。
2.批內與批間應分別小于 9%和 15%
檢測范圍：
檢測范圍：5pg/ml→400pg/ml。
保存條件及有效期：
保存：2-8℃。
有效期：6 個月(2-8℃)。
準備試劑，樣品和標準品
加入準備好的樣品和標準品，生物素標記的二抗和酶標試劑，37℃反應 60 分鐘
洗板 5 次，加入顯色液 A、B，37℃顯色 15 分鐘
加入終止液
10 分鐘內讀 OD 值
計算
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Rat 8-Hydroxy-desoxyguanosine
ELISA Kit
Instruction
This kit is only for scientific research, and shall not be used as a clinical diagnosis of use. Purpose
This kit allows for the determination of 8-OHdG concentrations in Rat serum, cell culture
supernatant, and other biological fluids. Principle
The kit assay Rat 8-OHdG level in the sample，add Rat 8-OHdG antibody to microtiter plate
wells, after Incubating,add Biotinylated anti –8-OHdG -antibody , then Combined
Streptavidin-HRP, become complex, after Incubating and washing Compley, Add TMB
substrate solution,TMB substrate becomes blue color, reaction is terminated by the addition of
a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a
wavelength of 450 nm. The concentration of 8-OHdG in the samples is then determined by
comparing the O.D. of the samples to the standard curve. Materials provided with the kit
Materials provided with the
kit 48determinations 96 determinations Storage
User manual 1 1
Closure plate membrane 2 2
Sealed bags 1 1
Microelisa stripplate 1 1 2-8℃
Standard：800pg/ml 0.5ml×1 bottle 0.5ml×1 bottle 2-8℃
Standard diluent 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
Streptavidin-HRP 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
Biotinylated anti –8-OHdG
-antibody
0.5ml×1 bottle 1ml×1 bottle 2-8℃
Chromogen Solution A 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
Chromogen Solution B 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
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Stop Solution 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
wash solution
（20ml×20 fold）
×1bottle
（20ml×30 fold）
×1bottle
2-8℃
Materials required but not supplied
1. 37 ℃ incubator
2. Standard microplate reader(450nm)
3. Precision pipettes and Disposable pipette tips. 4. deionized water. 5. Disposable Test tube
6 Absorbent paper
Important notes
1. The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes in
the room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should
be stored in Sealed bag. 2. add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids the
experimental error. 3. Please according to use 8-OHdGtruction strictly, The test result determination must take
the microtiter plate reader as a standard. 4. Use new disposal plastic pipette tips and Closure plate membrane for each standard, in
order to avoid cross contamination. 5. Do not mix reagents with those from other lots. 6. The substrate evade the light preservation. Specimen requirements
1. extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevant
literature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t, specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles. 2. Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active.
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Assay procedure
1. Dilute and add sample:Dilute Original density Standard as follow table:
400pg/ml 5 Standard 120μl Original density Standard+120μl Standard diluent
200pg/ml 4 Standard 120μl 5 Standard+120μl Standard diluent
100pg/ml 3 Standard 120μl 4 Standard+120μl Standard diluent
50pg/ml 2 Standard 120μl 3 Standard +120μl Standard diluent
25pg/ml 1 Standard 120μl 2 Standard +120μl Standard diluent
2. according testing Sample numbers to define how many wells nedd, Standard and blank
suggested Do holes. 3.add sample：1) blank wells: (blank comparison wells don’t add sample , Biotinylated anti –8-OHdG -antibody and Streptavidin-HRP ,other each step operation is same); 2) Standard
wells: add Standard 50μl and Streptavidin-HRP 50μl; 3) testing Sample wells: add sample
40μl,then add anti –8-OHdG-antibody 10μl , Streptavidin-HRP 50μl. closing plate with Closure
plate membrane ,incubate for 60 min at 37℃. 4.Configurate liquid: 30-fold(or 20-fold) wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled
water and reserve. 5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer
to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat. 6.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the
light preservation for 15 min at 37℃
7.Stop the reaction ： Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction(the blue color
change to yellow color). 8.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and
within 10min. 9. Calculate of result
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