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蛋白質(zhì)的定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)
  • 發(fā)布日期:2011-12-23      瀏覽次數(shù):1792
    •                                                      蛋白質(zhì)的定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)

      蛋白質(zhì)定量是生物化學(xué)、食品檢驗(yàn)和其它生命學(xué)科zui常涉及的分析內(nèi)容,是臨床診斷的重要指標(biāo),也是許多生物制品、藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。生化實(shí)驗(yàn)中,在對(duì)生化藥品,特別是蛋白質(zhì)、酶、某些多肽或蛋白質(zhì)激素的分離純化時(shí),對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析是非常重要的。
          然而蛋白質(zhì)的種類很多,結(jié)構(gòu)不均一,分子量又相差很大,功能各異,這給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來(lái)了很大的困難。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種,不同的方法各有其特點(diǎn)。
          紫外分光光度法是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的;而凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法、BCA法、膠體金法測(cè)試根據(jù)蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的;根據(jù)蛋白質(zhì)的染色性質(zhì)的不同,又建立了考馬氏亮藍(lán)染色法和銀染法;此外還有人在這些蛋白質(zhì)定量方法的基礎(chǔ)上建立了熒光法。
          由于每種方法都有其自身的特點(diǎn)和局限性,因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)測(cè)定方法,以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果zui,但操作復(fù)雜,用于大批量樣品的測(cè)試則不太合格;雙縮脲法操作簡(jiǎn)單,線性關(guān)系好,但靈敏度差,樣品需要量大,測(cè)量范圍窄,因此在科研上的應(yīng)用受到限制;而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn),它結(jié)合了雙縮脲法中銅鹽反應(yīng)與Folin-ciocalteau試劑反應(yīng)的特點(diǎn),因而在科研中被廣泛采用,但是它的干擾因素較多;考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而簡(jiǎn)便開始重新受到關(guān)注;BCA法以其試劑穩(wěn)定,抗干擾能力較強(qiáng),結(jié)果穩(wěn)定,靈敏度高而受到歡迎;而膠體金法具有較高的靈敏度,可達(dá)到毫微克水平,用于微量蛋白的測(cè)定。


                               附:常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較

      方   法
      測(cè)定范圍
      (μg/ml)
      不同種類
      蛋白的差異
      zui大吸收
      波長(zhǎng)(nm)
      特                 點(diǎn)
      凱氏定氮法
       
       
      標(biāo)準(zhǔn)方法,準(zhǔn)確,操作麻煩,費(fèi)時(shí),靈敏度低,適用于標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定
      紫外分光光度法
      100—1000
      280
      205
      靈敏,快速,不消耗樣品,核酸類物質(zhì)有影響
       
       
      雙縮脲法
      1000—10000
      540
      重復(fù)性、線性關(guān)系好,靈敏度低,測(cè)定范圍窄,樣品需要量大
      Folin-酚試劑法
      20—500
      750
      靈敏,費(fèi)時(shí)較長(zhǎng),干擾物質(zhì)多
      考馬氏亮藍(lán)G-250
      50—500
      595
      靈敏度高,穩(wěn)定,誤差較大,顏色會(huì)轉(zhuǎn)移
      BCA
      50—500
      562
      靈敏度高,穩(wěn)定,干擾因素少,費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)