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大鼠IV型膠原酶（COL-IV）酶聯(lián)免疫檢測(cè)
  • 發(fā)布日期：2019-05-17      瀏覽次數(shù)：1164

      • 大鼠IV型膠原酶(COL-IV)酶聯(lián)免疫

               檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書     AE90665Ra

      使用前仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術(shù)原理，來(lái)檢測(cè)大鼠IV型膠原酶(COL-IV)，只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。

      用   途：用于大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中IV型膠原酶(COL-IV)測(cè)定。

      工作原理:

      本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定樣品中大鼠IV型膠原酶(COL-IV)水平。向預(yù)先包被了大鼠IV型膠原酶(COL-IV)單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入大鼠IV型膠原酶(COL-IV)，溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗IV型膠原酶(COL-IV)抗體。再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠IV型膠原酶(COL-IV)的濃度呈正相關(guān)。

       

      試劑盒組成: 

      試劑盒組成

      48孔配置

      96孔配置

      保存

      說(shuō)明書

      1份

      1份

       

      封板膜

      2片（48）

      2片（96）

       

      密封袋

      1個(gè)

      1個(gè)

       

      酶標(biāo)包被板

      1×48

      1×96

      2-8℃保存

      標(biāo)準(zhǔn)品12ng/ml

      0.5ml×1瓶

      0.5ml×1瓶

      2-8℃保存

      標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

      3ml×1瓶

      6ml×1瓶

      2-8℃保存

      鏈霉親和素-HRP

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      生物素標(biāo)記的抗COL-IV抗體

      0.5ml×1瓶

      1 ml×1瓶

      2-8℃保存

      顯色劑A液

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      顯色劑B液

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      終止液

      3ml×1瓶

      6ml×1瓶

      2-8℃保存

      濃縮洗滌液

      （20ml×20倍）×1瓶

      （20ml×30倍）×1瓶

      2-8℃保存

       

      需要而未提供的試劑和器材:

      • 37℃恒溫箱。
      • 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
      • 精密移液器及一次性吸頭
      • 蒸餾水，
      • 一次性試管
      • 吸水紙

       

      注意事項(xiàng):

      • 從2-8℃取出的試劑盒，在開(kāi)啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
      • 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差
      • 嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
      • 為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。
      • 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
      • 底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。

       

      洗板方法:

      手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

      自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

       

      標(biāo)本要求: 

      1．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

      2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

       

      操作程序:

      • 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。)

      6ng/ml

      5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

      120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

      3ng/ml

      4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

      120μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

      1.5ng/ml

      3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

      120μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

      0.75ng/ml

      2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

      120μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

      0.375ng/ml

      1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

      120μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

       

      • 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量 做復(fù)孔。
      • 加樣：1）空白孔，空白對(duì)照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗COL-IV抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；2）標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加)；3）待測(cè)樣品孔：加入樣本40ul，然后各加入抗COL-IV抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60分鐘。 
      • 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
      • 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
      • 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘. 
      • 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
      • 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
      • 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。

       

      操作程序總結(jié)：

       

      試劑盒性能：

      1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上。

      2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和15%

       

      檢測(cè)范圍：

      檢測(cè)范圍：0.2ng/ml - 9 ng/ml

       

      保存條件及有效期：

      保存：2-8℃。

      有效期：6個(gè)月(2-8℃)。